医学检验常用染色方法(6篇)
医学检验常用染色方法篇1
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染，是医院感染的重要病原菌之一。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。尤其是自20世纪耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)出现以来,由于其多重耐药性和易造成医院内感染的暴发流行,已成为临床抗感染治疗的难点。为了解我院MRSA的耐药特点,为临床医师提供可靠的治疗依据非常必要,我们对临床标本中分离的金黄色葡萄球菌进行了耐药性分析,报道如下。
1材料与方法
菌株来源所有菌株均来自2010年1月-2011年9月期间,从我院住院患者送检的各类临床标本(痰液、脓液、穿刺液、伤口分泌物、尿液、血液等)中进行分离、培养和鉴定。操作程序严格按照《全国临床检验操作规程》,采用常规方法进行,质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923,购自国家药品生物制品检定所。
抗菌药纸片青霉素、万古霉素、左氧氟沙星、庆大霉素、环丙沙星、阿米卡星、红霉素、利福平、头孢呋辛、林可霉素、氨苄西林、克林霉素、头孢噻肟，均购自北京天坛生物制品鉴定所。
方法采用K-B(Kirby-Bauer)纸片扩散法，操作按美国国立临床实验室标准化委员会(NCCLS)2005年标准进行MRSA菌株的鉴定采用NCCLS(2005年)推荐的头孢西丁法筛选MRSA。
2结果
标本分布所有送检的标本检出金黄色葡萄球菌189株,其中来自痰液和咽试子93株，占49.21%；来自皮肤黏膜有48株，占25.40%；来自腹水、胸水、脑脊液的有21株，占11.11%；从尿液中检出14株，占7.41%；从血液标本中检出13株，占6.87%。
耐甲氧西林金黄色葡的检出率189株金黄色葡萄球菌菌株中MRSA萄球菌80株,占42.23%。
耐药情况189株金黄色葡萄球菌株对13中抗生素的耐药情况见下表。
表1金黄色葡萄球菌对各种抗菌药物的耐药率(%)
3讨论
近年来，随着广谱抗菌药物的研究开发与临床的广泛应用,在革兰阴性杆菌感染得到有效控制的同时,革兰阳性球菌感染呈上升趋势。金黄色葡萄球菌是常见细菌感染。尤其是耐甲氧西林葡萄球菌是造成医院感染的主要病原菌之一，具有多重耐药性，其对常用抗生素的敏感性比甲氧西林敏感葡萄球菌明显降低，合理使用抗生素对于有效治疗其感染和控制其流行至关重要。而及时准确的检测是临床合理使用抗生素的重要步骤。
本组资料显示，75%左右的菌株来自痰液、咽试子和或皮肤黏膜，表明金黄色葡萄球菌和MRSA主要来自呼吸道、皮肤黏膜、手术切口等好发部位，提醒医务工作者应该加强该部位的护理和检测，有效预防和及时控制感染的发生。
从表1结果可以看出,MRSA对常用抗菌药物的耐药率明显高于MSSA。但两者对对抗生素的敏感程度存在很大的差异，且万古霉素敏感率均为100.0%,这对临床选用药物有重要参考价值,因此,临床医师应根据细菌药敏试验结果选择使用抗菌药物,预防细菌耐药性的产生与扩散。
参考文献
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医学检验常用染色方法篇2
【关键词】烧伤病房耐甲氧西林金黄色葡萄球菌医院感染控制
感染是烧伤常见并发症和三大死亡原因之一［1］，烧伤病房是医院感染的高发科室。分析烧伤病房耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染原因，采取相应的防控措施，可以减少院内感染。我院2008年6月同时发生的2例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染患者及之后陆续发生的3例MRSA感染患者进行分析调查，报道如下。
1资料与方法
1.1调查对象2008年6月～11月，烧伤监护病房5例MRSA感染危重患者；此期间科室从事医疗服务、诊疗操作的医护人员及房间布局、设置。
1.2诊断标准5例MRSA患者参照中华人民共和国《医院感染诊断标准》为诊断依据。
1.3调查方法运用流行病学方法，对5例MRSA患者进行前瞻性监测，严密观察病情变化，关注实验室检查结果通过与医护人员交谈，查阅病历掌握患者情况；通过仔细观察医护人员诊疗操作过程，询问医院感染相关知识，巡视ICU布局、设置，掌握医护人员及环境情况。
1.4标本采集按照卫生部《消毒技术规范》2002年为采样标准，进行创面分泌物细菌培养检查采样。
1.5菌株鉴定及药敏试验金黄色葡萄球菌菌株分离鉴定，所有标本按常规方法分离培养，所分离到的菌株用法国梅里埃公司VITEK32自动微生物鉴定仪GPI卡及金黄色葡萄球菌SlidexStapPlus试剂盒加以鉴定，抗菌药物敏感试验采用纸片扩散法（KB法），判读采用美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）2004年规定的临界值判定耐药（R）、中介（I）和敏感（S），MRSA的监测采用北京天坛生物研究所提供30μg/片头孢西丁纸片法检测，结果按美国2004年CLSI/NCCLS标准判读。质量控制，药敏试验质控菌株为ATCC25923金黄色葡萄球菌，MRSA参考菌株为ATCC43330。数据统计分析：药敏统计软件采用WHONET5。
2结果
2.1感染病例基本情况5例患者中，4例男性，年龄32～56岁，平均38.7岁；1例女性，年龄为34岁。5例患者均为≧30%深Ⅱ度～Ⅲ度烧伤，入住烧伤监护病房后，创面分泌物培养检出MRSA。其中2008年6月12日送检的2例病人为同株MRSA感染，复查3次，检出结果相同。7月～11月陆续发生其余3例MRSA感染，因时间不相同，未进行菌株鉴定。5例患者MRSA药敏结果均对万古霉素敏感，其他耐药。经有效抗感染治疗，感染得到控制，创面生理性愈合。
2.2病原学检测专职人员共采集标本64份，阳性31份，阳性率48.44%。见表1。
表1发生MRSA感染病原学监测及构成比（略）
3讨论
3.1MRSA感染暴发的危险因素大面积烧伤后期常因病人贫血、低蛋白血症、维生素缺乏致抵抗力下降，或是Ⅲ度创面所植皮片间隙过大，皮片过薄或勉强自愈的深Ⅱ度创面，以及取皮较深的供皮区在受压、摩擦等外力作用下破溃不愈的创面。这些创面常合并细菌感染，一旦发生MRSA感染，则创面可见较多粘稠脓性分泌物，创缘上皮生长停滞，出现较多过度角化上皮痂，因痂下潜藏小脓点而形成虫蚀状或斑片状溃疡，并逐步扩大，虽经常规换药治疗，但创面感染此起彼伏，很难控制［2］。
2008年6月烧伤科报告其监护病房发生2例同株MRSA感染，说明存在院内感染隐患。通过病原学检测，物体表面、空气确实存在污染现象。患者均无自主行动，同株MRSA感染考虑医护人员可能性最大，从病原学监测结果分析，阳性标本均为医护人员不同部位的带菌，这为切断传播途径提供了科学有力的依据。
3.2控制措施（1）硬件设施改善：原有动态消毒机进行过滤网清洗，安装换气扇，改善空气质量；配置流动洗手车1台，方便医护人员洗手。（2）环境治理：MRSA感染带菌患者集中隔离，设置隔离病房、专人管理；对病房地面、墙面、屋顶及卫生死角区域进行彻底大扫除，用1000mg/L含氯消毒剂擦拭消毒处理；隔离病房在确保患者安全的情况下，每天进行紫外线照射30min。（3）隔离病房的管理：进入隔离病房必须穿隔离衣，患者专人护理；病房内配流动洗手车1台，每床配备快速手消毒剂，每次诊疗操作结束后必须严格认真消毒处理手；对于患者使用后污染严重、无法处理的物品，采用一次性使用；隔离病房的所有物品采用臭氧进行消毒处理后，才能离开病房并单独存放；隔离病房用后的织物，用臭氧初消后封装好，送洗衣房再用2000mg/L含氯消毒剂处理后方可清洗。（4）医护人员的管理：要求进入隔离病房人员二次更衣，专用工作服每日更换；接触患者必须穿隔离衣，配戴帽子、口罩。（5）感染患者的管理：MRSA隔离患者，严格床旁隔离并专人护理；根据创面分泌物培养结果谨慎选择抗菌药物，谨防其他医院感染发生［3］。
手是导致医院感染的主要媒介，为有效预防医院感染，防止MRSA医院感染暴发流行，医护人员必须高度警惕，提高医院感染控制意识，严格规范各项诊疗操作。MRSA导致的感染性疾病具有难治性已成为临床医生的棘手问题［4］。有文献［5］报道，医护人员手MRSA检出率为71.8%，为杜绝手作为传播途径，对医护人员手的清洗消毒要严格要求，提到相当高度。
参考文献
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医学检验常用染色方法篇3
【关键词】下呼吸道感染；病原菌；耐药分析
下呼吸道感染是呼吸内科最常见的感染性疾病，包括慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张等。多由病毒、细菌、军团菌等微生物感染引起。治疗须明确引起感染的病原体以选择有效的抗生素[1]。由于临床抗生素的滥用，下呼吸道感染分离的耐药菌株多重耐药、交叉耐药严重，尤其大剂量头孢菌素的应用，导致院内感染特别是假单孢铜绿杆菌和肠球菌感染日益增多。本研究旨在分析呼吸内科下呼吸道感染病原菌的分布、药物敏感性及耐药情况，以指导临床合理用药及抗感染治疗，报告如下。
1材料与方法
1.1菌株来源选取本院呼吸内科2014年12月～2015年6月下呼吸道感染患者送检的痰标本456份，经培养分离病原菌280株，检出率为61.4%。受检者晨起漱口后自行深咳或经纤支镜取痰液于无菌痰杯内，30min内送检，涂片镜检结果白细胞与上皮细胞的比值>2.5为合格痰标本（同患者多次送检标本分离菌株相同按1株计算），否则重新留取。
1.2方法痰标本的分离、培养及鉴定，均严格按《全国临床检验操作规程》第3版进行。法国梅里埃公司生产的VITEK32全自动微生物分析仪对不同细菌分别应用特异性生化板菌株鉴定，鉴定可信度>95%。药物敏感试验采用纸片扩散法（K-B）法，质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC28753，均购自河南省临床检验中心，并根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）2013标准判定。结果输入SPSS15.0软件统计分析。
2结果
2.1病原菌构成及结果456份标本经培养分离出280株病原菌，其中G+球菌57株（20.4%）；G-杆菌198株（70.7%）；真菌25株（8.9%）。G+球菌主要为金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌；G-杆菌主要为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、不动杆菌、大肠埃希氏菌；真菌主要为白假丝酵母菌。见表1。
2.2主要G-杆菌对常见抗菌药耐药性分析G-杆菌中铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、不动杆菌和大肠埃希菌对亚胺培南的耐药率均为0。见表2。
2.3主要G+球菌对常见抗菌药耐药性分析G+球菌中金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和肠球菌对万古霉素、替考拉宁的耐药率均为0。见表3。
3讨论
临床广谱抗菌药的泛滥使用及疾病的地区性差异，使不同医院的下呼吸道感染病原构成及耐药史不断变迁[2-5]。本研究结果显示，本院呼吸科分离的病原菌以G-杆菌为主，占70.7%，与相关报道一致。分离率位居前五位的细菌分别为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、不动杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌。铜绿假单胞菌在本研究中分离数量最多，常伴随毒力较强细菌存于病灶，感染多发生于衰弱或免疫低下者，耐药机制与病原菌产生抗菌活性酶，改变抗菌药作用靶位，形成生物膜及主动泵出系统等有关。铜绿假单胞菌对青霉素类，一、二代头孢菌素类等耐药率较高，对亚胺培南、三代头孢素类、氨基糖苷类、喹诺酮类等敏感性较好。本研究中未检出亚胺培南耐药菌株，但由于其易致二重感染，耐药菌和霉菌进驻率高达3.5%和9.2%，建议作为治疗混合感染的二线用药。肺炎克雷伯菌是临床分离及医院感染的重要致病菌之一，由于β-内酰胺类及氨基糖苷类等广泛使用，细菌易产生超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和头孢菌素酶（AmpC酶）及氨基糖苷类修饰酶（AMEs），对第三代头孢菌素和氨基糖苷类常多重耐药，导致治疗的失败和病程迁延。药检结果显示，对亚胺培南最敏感，对喹诺酮类、三代头孢素类相对敏感，对氨苄西林等青霉素类高度耐药达60%～70%。不动杆菌引起的感染仅次于铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌，是引起外源性感染的主要因素，自身免疫力低下，呼吸道分泌功能减弱、纤毛运动减弱，痰液无法及时排除，及呼吸机的侵入性操作都导致其发病率、耐药率不断增高。除碳青霉烯类对不动杆菌保持100%的抗菌活性外，氨苄西林，头孢哌酮也保持70%以上的抗菌活性。不过不动杆菌已出现泛耐药菌株，抗感染治疗时可考虑大剂量舒巴坦联合碳青酶烯类、替加环素等方案。大肠埃希菌产ESBLs检出率逐年上升，对亚胺培南、三代头孢素类耐药率低均低于40%，对哌拉西林、氨苄西林耐药率均高于60%，均国内报道以一致[6-11]。
近年来，葡萄球菌对β-内酰胺类抗菌素率逐年上升，可能与近年第四五代头孢类、氟喹诺酮类药物控制较松及葡萄球菌属耐药性传递有关。耐甲氧西林（MRSA）菌株占金黄色葡萄球菌的68.4%.且对所有的B-内酰胺类药物均高度耐药。主要G+球菌未分离出万古霉素及替考拉宁菌株。因此适当应用替考拉宁和万古霉素为治疗多重耐药的葡萄球菌首选。本科室真菌感染主要为白假丝酵母菌。真菌感染上升的主要源头在于抗生素的广泛应用，所涉及的患者主要为长期卧床，慢阻肺及长期使用抗生素者[12，13]。因此通过本组下呼吸道感染病原菌分布及耐药特点，说明本院呼吸内科的下呼吸道感染患者致病菌以G-杆菌为主，细菌耐药当今形势严重，尽早明确致病菌，使用抗菌药物应合理规范适当，以提高治愈率。
参考文献
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医学检验常用染色方法篇4
日照市东港区人民医院检验科，山东日照276800
[摘要]目的对血培养阳性标本直接细菌鉴定和药敏进行分析。方法研究我院收治的发热合并全身感染患者86例，在专用接种水中混掺患者的血培养标本，并在鉴定板上接种，通过直接法鉴定，同时把阳性标本转种平板进行分离培养，根据常规法对分纯后的菌落实施上机鉴定及药敏实验，然后进行对比。结果在86例样品当中，直接法和常规法符合率：细菌鉴定总符合率为96.4%，其中革兰阴性菌95.8%，革兰阳性球菌97.1%；两种方法的细菌结果均有着较高的准确率，细菌鉴定准确率在95.7%以上。结论血培养阳性标本直接细菌鉴定和药敏实验能够准确的早期诊断菌血症患者，值得推广。
[
关键词]血培养；阳性标本；细菌鉴定；药敏实验
[中图分类号]R446
[文献标识码]A
[文章编号]1672-5654（2014）05（c）-0001-02
Directbacterialidentificationandsusceptibilityanalysisofpositivebloodculturespecimens
LIYan
DepartmentofDonggangRizhaoCityDistrictPeople´sHospital，Rizhao276800,China
[Abstract]ObjectiveDirectlyonpositivebloodculturespecimenswereanalyzedbacterialidentificationandsusceptibility.MethodsFevercombinedstudyofsystemicinfectioninourhospital86patientsvaccinatedinspecialwaterblendingbloodculturespecimensofpatients,andintheidentificationofinoculationplate,identifiedbythedirectmethod,whilethetransferofpositivesampleswereisolatedandculturedspeciestablet,accordingtoconventionalActonthecoloniesaftertheimplementationofapuremachineidentificationandsusceptibilitytesting,andthencompared.ResultsIn86samples,methodfortheidentificationofsusceptibilitydirectlywiththerateof96.4%,thetestresultsofP<0.05,nostatisticalsignificance;theresultsofbacteriaidentificationaccuracy,directmethodfortheidentificationofupto97.1%,thetestresultsofP<0.05,nostatisticalsignificance.ConclusionBloodculturepositivespecimensdirectbacterialidentificationandsusceptibilitytestingcanaccuratelydiagnosebacteremiainpatientswithearlystage,itisworthpromoting.
[Keywords]Bloodculture;Positivesamples;Dentificationofbacteria;Drugsensitivitytest
在现代临床当中，细菌感染属于常见的感染疾病，有着很高的发病与死亡率，对患者的日常生活造成了严重影响。作为微生物检验当中的重要部分，血培养有利于临床上对病原菌与对抗菌药物敏感性等进行及早明确，使诊断疾病的时间得到缩短，并使临床疗效得到提高[1]。为了对血培养阳性标本直接细菌鉴定和药敏实验的应用价值进行分析，本研究回顾分析了我院收治的86例发热合并细菌感染患者的临床资料，具体如下。
1资料与方法
1.1一般资料
资料源自2013年1月—2014年1月我院收治的发热合并全身感染患者86例，男50例，女36例，年龄在8~82岁之间，平均年龄为（46.7±8.2）岁。
1.2检测仪器与试剂
全自动血培养仪采用BACTEC9120型，血培养瓶为标准树脂型，以上均由BD公司（美国）提供；采用DadeBehring公司（美国）提供的全自动微生物分析仪（MicroScanWA96）、G-菌鉴定与G+菌鉴定及药敏复合板。运用OXOID公司提供的巧克力平板、分离用血平板以及中国蓝平板。质控菌株：ATCC25923（金黄色葡萄球菌）、ATCC25922（大肠埃希菌）和ATCC27853（铜绿假单胞菌）。
1.3鉴定与实验方式
1.3.1直接细菌鉴定法在BACTEC9120阳性报警之后，把阳性瓶取出。抽取培养液5mL（运用一次性注射器）并注入到试管（带有分离胶）中，把离心机中3000rpm放置离心15min，可将其分成黄色血浆、灰白色细菌、透明分离胶和红色血球等4层。对上清血浆运用加样枪吸弃，对分离胶上层的可以通过肉眼看到的灰白色菌液沉淀进行收集，由于在离心试管时角度会倾斜，会导致菌液在离心后向试管一侧集中，通过加样枪把灰白色菌液吸取出来，并放入到1.5mL的无菌管当中。如操作当中对分离胶进行了接触，可通过无菌生理盐水对混有分离胶的菌液进行洗涤，之后再进行离心，接着再用加样枪把灰白色菌液吸取出来。此方式可多次反复，以保证不会有分离胶存于菌液中。与此同时，对菌液实施革兰染色涂片，并对比阳性血培养液直接涂片革兰染色结果，以对相应鉴定卡进行选择。沉淀菌液通过无菌盐水0.45%制作成0.50~0.63麦氏浊度直接接种对应的鉴定卡以及药敏卡实施上机实验。
1.3.2常规检测在BACTEC9120阳性报警之后，把阳性瓶取出。对0.2mL培养液通过一次性注射器无菌抽取并接种于巧克力平板、分离用血平板以及中国蓝平板上。在35℃的温度中培养18~24h，在生成菌落之后实施革兰染色，在用相应的鉴定卡以及药敏卡实施上机实验。
1.4统计学方式
通过spss15.0软件对以上数据进行统计学处理，以χ2检验计数资料比较，P＜0.05说明具有统计学意义。
2结果
2.1两种方式鉴定药敏结果符合率
在86份血培养阳性标本当中，有83株细菌是常规法鉴定出的，其中48株为革兰阴性杆菌，35株为革兰阳性球菌，另3株是两种方式都无法鉴定出来的细菌。两种方法达到了96.4%的细菌鉴定总一致率（77/83），其中革兰阴性杆菌为95.8%（46/48）的一致率、革兰阳性球菌为97.1%（34/35）的一致率。见表1。
2.2两种检测方式细菌鉴定结果准确率
把86株细菌药敏实验结果进行对比，两种方法的细菌结果均有着较高的准确率，细菌鉴定准确率在95.7%以上。见表2。
3讨论
临床上在诊断与治疗败血症和菌血症上，血培养是关键所在。尽管许多医院都通过全自动血培养系统来使血培养阳性率得到提高，然而如何快速准确的菌种鉴定以及药敏实验血培养标本，是相关部门需要解决的课题。
依照常规方式对血培养阳性标本实施细菌鉴定以及药敏实验，通常要花费2~3d的时间。对病原菌进行明确，并早诊断和早治疗是成功治疗菌血症的关键。本研究通过直接法对血培养阳性标本实施细菌鉴定以及药敏实验，把常规分离的培养步骤有效省去，药敏结果可提前24h获得[4]，并且在对86例血培养阳性标本细菌鉴定结果上，相比传统方式均达到了96.4%的药敏鉴定总一致率（80/83），其中革兰阴性杆菌为95.8%（46/48）的一致率、革兰阳性球菌为97.1%（34/35）的一致率，同时，在药敏实验符合率上，两种检测方式的符合率也均在96.4%以上，这与相关文献[5-6]所报道的总一致率86.7%的结果要高，这可能和细菌自身对培养环境有着较高要求，在鉴定板当中缓慢生长抑或生长不充分有着一定关系；同时血培养液当中少量血液细胞以及纤维成分也会对测试板的生化反应结果造成影响。对于菌种鉴定结果来说，临床医生更相对药敏结果。本研究在对血培养阳性标本细菌鉴定一致性进行比较的同时，还对两种方式的药敏检测结果准确率做了对比，结果发现两者的准确率达到了97.1%。根据相应要求，一种新方式的建立要和参考方式作对比，准确率要在90%以上。结果证实采用直接法药敏试验阳性血培养标本，检测结果较为满意。
在细菌检测以及药敏试验血培养阳性标本时，相比常规法，直接法的诊断符合率与之差异不显著，而血培养阳性标本直接细菌鉴定和药敏实验能够准确的早期诊断菌血症患者，值得推广。
[
参考文献]
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医学检验常用染色方法篇5
[关键词]纤支镜毛刷；细胞块；常规HE染色；免疫组化；10%中尔马林
[中图分类号]R446.6；R361.3[文献标识码]B[文章编号]1673-9701（2013）36-075-03
Theapplicationmethodsandvalueoffiberlensbrushcellblocktechnique
ZHANGGuizhenZHUZhendaCHENCheng
DepartmentofPathology，YuhangDistrictTraditionalChineseMedicineHospitalofHangzhouCityinZhejiangProvince，Hangzhou311106，China
[Abstract]ObjectiveTostudytheapplicationmethodsandvalueoffiberlensbrushcellblocktechnique.MethodsFor32casesoffiberlensbrushafterconventionalsmearintheremainingcellsagainfixedwith10%formaldehydewaxblockmadefromcells（cellblock，CB），thefirstroutineHEstaining，againtochooseaccordingtotheneedtoenzymeimmunohistochemicalmarkingline.ResultsCBroutineHEstainingcellsclear，histologicstructuretoacertainextent，wasconducivetocleardiagnosis；Immunohistochemicalpositiveforaccuratepositioning，colorclear，hasgoodeffectfortumorclassification.Twodyeingmethodswerebetterthanregularsmeardyeingeffect，sothesignificantdifferenceofstatisticallywassignificant（P<0.01），andthelungbiopsyandpostoperativebiopsydifferencewasnotsignificant（P>0.05）.ConclusionTheproductionmethodofthefiberlensbrushCBfixedwith10%offormaldehydeissimple，economicandThedyeingeffectisgood，inthediagnosisofpulmonarydiseases，especiallylungcancerhasahighpracticalvalueandbroadapplicationprospect，theproductionmethodisworthpromoting.
[Keywords]Fiberlensbrush；Cellblock；RoutineHEstaining；Immunohistochemical；10%formaldehyde
纤支镜毛刷细胞学检查是诊断肺疾病、特别是肺肿瘤的重要手段之一，已被广泛用于临床，当纤支镜活检和经皮肺穿刺活检由于多种因素被迫放弃，此时的纤支镜毛刷细胞学检查是术前最佳的病理检查方法，显得尤为重要，并对已不适合手术治疗的老弱患者和晚期癌症患者来说也是较佳的病理检查方法。笔者对32例纤支镜毛刷常规涂片后再将剩余细胞制成细胞蜡块（cellblock，CB），先行常规HE染色镜下观察，再根据需要选择酶标行免疫组化（如CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、34βE12、TTF-1等），两者结合观察，对肺疾病进行病理诊断，特别是对肺肿瘤进行组织学上的分型，效果较好，现报道如下。
1资料与方法
1.1实验材料
50mL尖底塑料试管1支，直立平衡离心机1台，盛10mL10%中尔马林的小瓶1只，老虎钳1把，震荡器1台。
1.2方法
1.2.1毛刷处理毛刷刷取细胞后快速涂片2张，95%乙醇迅速固定，常规HE染色。涂片后马上用老虎钳剪断毛刷放入盛有10mL的10%中尔马林的瓶内固定。
1.2.2制片方法毛刷在10%中尔马林液固定1h后用干净的镊子取出，用针尖挑（或刮）出刷内物，尽量挑干净，再把毛刷在固定液内漂洗，而后把固定液倒入试管内。再重新倒入10mL左右的10%中尔马林在瓶内，在震荡器上震下刷内残余的细胞，再把这10mL的中尔马林倒入同试管内，再加一定的量，使试管内的福尔马林总量达30～40mL，离心3000r/min、15min，取出放在试管架上固定2～4h左右，如标本上午送来的则当天即可与常规组织同脱水，如下午两三点后送来则固定过夜。固定好后倒去固定液，此时沉淀物已结块，小心取出，放在滤纸上滴入伊红包好，与常规组织同时进行脱水、包埋予0.4mm厚连续切片8张左右，其中1张常规HE染色镜下观察，再根据需要选择酶标行免疫组化。
1.2.3染色合格标准将常规HE合格标准定为：细胞清晰，核浆对比分明，组织学结构可有（或无），有利于明确诊断。将免疫组化合格标准定为：阳性定位准确，着色清晰，有助于肿瘤的分型。
1.2.4免疫组化方法CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、34βE12、TTF-1等单克隆抗体购于北京中杉公司，实验流程采用EnVision二步法。
1.2.5统计学处理采用SPSS16.0统计学软件处理。用Kolmegorov-Smirnov方法进行正态性检验，使用χ2检验对正态分布的构成比进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
40例肺纤支镜毛刷，先直接常规涂片，再将剩余细胞用10%中尔马林固定制成细胞蜡块（CB），除8例由于细胞数量过少或血过多等原因使CB制作失败外，成功的32例常规HE染色效果较好，细胞较清晰，有一定的组织结构；免疫组化则阳性定位准确、着色较清晰，与常规涂片相比差异有统计学意义（P<0.01）、与肺活检（或术后组织切片）相比差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
表1三种不同方法检测结果比较[n（%）]
图1、2CB中的片状异型鳞状上皮组织，HE，×10与×40
图3CB中的正常腺管状结构，HE，×40
图4CB中的支气管黏膜，×10
图5活检中的支气管黏膜，×10
图6术后常规切片对照，HE，×40
图7直接常规涂片对照，HE，×40
图834βE12在CB中的（与图1同片）阳性表达，Envision法，×10
图934βE12在直接常规涂片中的阳性表达，Envision法，×10
图1034βE12在术后常规切片中的阳性表达，Envision法，×10
图11CB中的片状鳞状上皮（右下）与坏死组织（左上）分界清，×10
图12术后切片中的鳞状上皮（上）与坏死组织（下）分界清，×10
3讨论
3.1纤支镜毛刷细胞块的HE染色效果
本方法制作的CB在HE染色上与文献报道[1]的相似：细胞境界、核膜、核染质、核仁清楚；也有一定的巢状、片状、管状结构组织学结构和排列方式[2]（图1、2、3、4），等同活检（图5）和术后切片（图6）的图像，两者染色效果对比差异无统计学意义（P>0.05）。而直接常规涂片最大的缺陷是细胞量少，很难看到组织学结构[3]，我们观察的病例大多似此，且常伴有细胞退变（图7），常与坏死物、血细胞混合，干扰细胞的分辨，给诊断带来一定的困难，两者染色效果对比差异有统计学意义（P<0.01）。
3.2纤支镜毛刷细胞块的免疫组化效果
本方法制作的CB在免疫组化上阳性定位准确，着色清晰，背景也清晰无干扰（图8），与活检和术后切片（图10）相似，两者染色效果对比差异无统计学意义（P>0.05）。而常规涂片免疫组化出现高背景染色，细胞集群呈三维结构，尤其是膜着色的更难判断[4]，着色有模糊朦胧（图9）的感觉，给判断带来一定的困难，两者染色效果对比差异有统计学意义（P<0.01）。
3.3纤支镜毛刷细胞块的制作体会
纤支镜毛刷常规涂片后再把毛刷内残留的物质挑（或刮）出再离心制成细胞块，优良的纤支镜毛刷技术和小心、耐心挑（或刮）出刷内残留物使有足够量的肿瘤细胞是成功制成CB的主要环节。毛刷内物固定1h左右后有一定硬度，易于挑（或刮）出，刷内物直接挑（或刮）出，对成小片状、小粒状刷下组织的破坏较小，很好地保存了原有的组织学结构（图4），再利用离心机的离心力把漂下、震下的分散细胞经过高度浓缩压紧，也一定程度地显示了组织学模式，并能显示涂片中不能显示的特征性组织结构，如鳞癌的角化珠、状结构、肿瘤的组织间质等[5]，又如我们观察到的片状上皮成分与坏死组织分界清（图11）及较完整的黏膜结构（图4）的图像，与活检（图5）和术后切片（图6、图12）极其相似，且又不浪费所刷取的任何材料。而直接常规涂片最大的缺陷是材料浪费，细胞量少，又很难看到组织学结构。现虽有较先进的液基细胞学技术，但经过振荡，标本中组织学结构大部分被离散，涂片中也很难看到组织学结构，又经过膜式过滤后，细胞量也相应减少，对刷取的材料仍有浪费。
我们不用95%乙醇固定，用10%中尔马林固定，是因为高浓度的乙醇可使组织细胞收缩和变脆，难以切片外，还可溶解红细胞中的血红蛋白[6]，在免疫组化染色时会干扰背景加重背景着色。有文献报道脱落细胞有完整的细胞膜，虽经乙醇固定，其包膜上的类脂质不能充分溶解，影响试剂的渗透造成真正的阳性细胞着色不良，影响结果判断[7，8]。10%中尔马林对组织渗透作用强，固定均匀、稳定，使组织具有一定的弹性，不仅易于切片外，还能很好地保存组织细胞的形态结构、保存大部分组织细胞内的物质如糖类、无机盐、色素、蛋白抗原等，使抗原定位更加清晰，尤其是对细胞核的抗原固定最佳[9]，利于进行免疫组化染色和分子生物学检验。我们制作和观察的病例大多有类似的结果，免疫组化效果较佳（图10）。但福尔马林渗透速度较乙醇慢，所以固定时间较长，一般要2～4h[10]，如果急需加快，也可采用付海洋等[9]介绍的方法：在前固定的基础上再利用超声波进行后固定，加速福尔马林对细胞的渗透和固定。另有文献报道常规涂片免疫组化细胞成分复杂，除有较强的非特异性背景着色外，三维细胞团免疫试剂容易进入产生假阳性[11]；CB免疫组化染色则背景干净，几乎没有假阳性[12]。
3.4纤支镜毛刷细胞块的应用前景
细胞块作为细胞学诊断中重要的辅助手段最初应用于胸腹水、心包积液等液体标本，在国外该技术已经成为脱落细胞学的常规操作技术，并已应用很久，目前国外普遍采用自动化制作细胞蜡块，但该方法设备成本较高且技术较为复杂[13]。传统的细胞块制作方法有琼脂或生物胶水包埋法、固定沉降法、血浆凝血酶凝集法、鸡蛋清凝集法和医用脱脂棉吸附法，不仅操作复杂，且通透性较差，影响脱水、透明和浸蜡，造成制片困难和染色效果差[14，15]。我们制作的方法较为简便，只需1台离心机用10%中尔马林固定，2～3d即可完成常规HE染色和免疫组化染色，并因未用任何媒介物，干扰图像较少，染色效果较佳，更易于镜下观察。CB还有优点是可以连续切片，用于多种酶标检测，如CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、34βE12、TTF-1等诊断肺肿瘤的酶标均可用上，以满足诊断需要。并可长期保存，其成本对实验而言也是最经济的。已有文献报道CB用于原位杂交检测定位准[16]，因条件限制，我们尚未开展，但是我们以后努力的方向。所以用10%中尔马林固定的纤支镜毛刷CB方法简便、经济、效果好，在诊断肺疾病、特别是肺肿瘤中有广阔的应用前景，值得推广。
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医学检验常用染色方法篇6
1.1一般资料
在本次研究中所选择的研究对象为我院2014年1月～2015年1月收治的需要进行妇科医学检验的患者120例，年龄24～51岁，平均年龄38岁，患者所患的妇科疾病种类有所不同，其中因为阴道炎而接受治疗的70例（58.3%），因为人工流产或者放置节育环而进行相关检验的30例（25%），因为妇科手术或者其他原因而进行医学检验的20例（16.7%）。所有患者的阴道分泌物的检验均在我院相关的检验室进行。
1.2方法
利用随机原理将患者平均分为两组，各60例，为了便于记录，把这两组分别命名为1组和2组，并把每一个小组都再分为对照组和观察组。分别把木质刮板以及棉签作为取样工具对患者阴道分泌物进行取样，在1组中采用盐水镜检法进行检测，在2组中运用革兰氏染色法对其进行检测。在利用盐水镜检法时，相关的检测人员必须注重氢氧化钠的加入，从而保证检测率的准确性。革兰氏染色法就是在对相关分泌物进行镜检前对其进行染色，进而观察相关的细菌的检出情况。
1.3统计学处理
本次研究中所有数据的获取以及分析均采用统计学软件SPSS19.0进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。另外为了方便相关研究的进行，把本次研究的结果以四张图标的形式所呈现。
2结果
通过相关验证性措施的采取，可以发现利用棉签作为取样工具的感染检出率高于以木质刮板作为取样工具的组别。其中利用棉签作为取样工具的综合检出率为84%，以木质刮板为取样工具的综合检出率为75%。利用革兰氏染色法比利用盐水镜检法的检出率要高，其中利用革兰氏染色法的综合检出率为93%，利用盐水镜检法的综合检出率为81%。
3讨论
